使用偏光顯微拉曼光譜分析蜘蛛絲的方向和二級結構

緒論

蜘蛛絲是一種卓越的蛋白質材料，其抗拉強度(Tensile strength)大於鋼鐵，同時比尼龍更具延展性，故以蜘蛛絲作為次世代材料都一直備受關注。它表現出部分結晶特性，其蛋白質分子在自組裝(Self-assembly)過程中平行於纖維軸(Fiber axis)方向。蠶絲中某些胺基酸殘基(Residues)的聚集決定了材料的彈性和強度；因此，蜘蛛絲有多種類型。典型的球網（Orb web，如圖 1）係由三種具有不同物理特性的纖維組成：拉線(Dragline)、放射線(Radial line)和螺旋線(Spiral line)。在此應用中，我們 將示範透過偏振拉曼顯微光譜對蛛絲蛋白進行結構分析。

圖1 蜘蛛絲類性圖說

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JASCO 拉曼光譜儀NRS-5500

實驗流程

對直徑為幾微米(μm)的三種蜘蛛絲（拉線、放射線和螺旋線）進行拉曼光譜測量，這些蜘蛛絲源自Oriental golden orb web spider(直譯為” 東方金球網蜘蛛”) 裡的 Nephila clavate(橫帶人面蜘蛛)。透過旋轉蜘蛛絲，使雷射光源的偏振方向可以與纖維軸平行(0°)或是正交(90°)。（拉曼測量條件，Ex：532 nm，光柵：600 lines/mm，物鏡倍率：100x）

圖2 雷射光源的偏振方向定義

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實驗結果

偏振拉曼測量光譜如圖 3 所示，數據顯示了蛋白質方向、二級結構和胺基酸組成的差異。蛋白質胜(Peptide)鍵的醯胺I (Amide I) 和醯胺III (Amide III)的特徵峰，分別表現在垂直或平行的分子軸方向震動。其峰值強度的比值，可以反映蛋白質分子方向性的程度。且由於蛋白質二級結構的差異，醯胺I和醯胺III的波峰位置會發生偏移。

根據醯胺I和醯胺III的峰值強度比值和位置分析，拉線和放射線蛋白主要沿著纖維軸的方向，並含有大量具有β折疊結構的結晶成分，這些被認為與蜘蛛絲在纖維軸方向上的抗拉強度有關。

螺旋線（用於捕捉獵物）具有低方向性，包含許多α螺旋和無規則缐圈(Random coil) 結構。這被認為與螺旋線纖維的延展性和彈性特性有關（如圖4）。此外，螺旋線纖維的光譜顯示，其表面具有富含脯氨酸(proline)的黏性成分。

圖3 偏振拉曼測量光譜數據

圖 4 拉線和螺旋線纖維蛋白質結構示意圖

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結論

在這個應用中，我們發現橫帶人面蜘蛛，可以根據需要產生不同分子結構的纖維絲。顯微拉曼可以在微米級的空間解析度測量樣品，且無需接觸即可獲得包含分子振動資訊的高品質光譜數據，對於蜘蛛絲等的結構分析非常有用。利用偏振光譜測量，可同時獲得結構方向的資訊；這使得它對於評估單纖維和多層薄膜等微小區域的方向性和成分非常有效。

補充資料（關於偏振測量）
透過偏振測量評估方向性時，有兩種方法：旋轉樣品和沿光軸旋轉偏振面。

(1) 旋轉樣品（本應用使用的方法：如圖5）
將拉曼光路側的偏振片（Analyzer）設定為與雷射光相同的偏振方向，並旋轉樣品。由於雷射光束側的偏振面不會移動，因此可以獲得強度穩定的光譜。透過連續旋轉樣品，可以繪製峰值強度的輪廓。

圖 5 旋轉樣品法

(2) 沿光軸旋轉偏振面（如圖6）
使用半波片 (Half-wave plate，HWP) 將雷射光束的偏振面旋轉 90 度。同時，拉曼光路側的偏光片（Analyzer）也旋轉90度。
旋轉雷射光束偏振面的方法受光路中各光學元件偏振特性的影響。因此，當考量方向對於峰值強度的影響時，必須校正垂直軸。當需要相同的測量位置旋轉偏振方向時(此時樣品無法移動)，會使用此方法。

圖6 沿光軸旋轉偏振面

參考資料
1) P.R. Carey, Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies.1982

*此應用資料是日本 JASCO 與名古屋市立大學自然科學研究生院 N. Katayama 教授共同研究計畫的成果。

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