Jasco | CD的全面性探索(下)
CD/ORD應用
CD/ORD應用分為四類：有機化合物、光學活性金屬配合物、蛋白質和多肽以及核酸。
有機化合物（Organic Compounds）
已知光學異構體（Optical Isomers）的識別
對映異構體的CD和ORD光譜形成完整的鏡像，可以識別光學異構體的配置。圖8展示了α-蒎烯（α-pinene）兩種光學異構體的CD光譜。可以看到光譜是垂直對稱的。基於已知配置的光學異構體的ORD和CD光譜，可以對具有類似結構的光學活性物質進行分析。
圖 7 、α-蒎烯（α-pinene）所得 CD光譜圖
通過實證規則（Empirical Rules）分析組態（Configuration）和構形（Conformation）
三維環境對發色團（Chromophore）周圍產生的科頓效應已得到廣泛研究，主要發色團的經驗規則列於表2中。
表 2、柯頓效應的經驗法則
激子手性方法（Exciton Chirality Method）
如果存在兩個或更多具有強烈Π-Π*帶的等效發色團，並且它們相對於彼此呈非對稱位置，則扭轉方向決定了柯頓效應的符號。這種方法是一種理論上確立的多功能方法，其中不顯示吸收的官能團，如雙醇（2-OH），被衍生為雙苯甲酸酯（圖9）以確定結構組態。
圖9、α-glycol dibenzoate手性結構組態
金屬配合物（Metal
Complexes）
六配位元八面體光學活性配合物
圖10、光學活性金屬配合物的ORD、CD和UV光譜
蛋白質和多胜肽（Proteins, Polypeptides）
根據CD光譜，可以估計蛋白質的基本結構，以及α-螺旋（α-helices）、β-折疊（β-sheets）和隨機捲曲的組成比例。圖11展示了Concanavalin A的CD光譜。在自然狀態下，它具有豐富的β-折疊結構，但通過氟乙醇（Fluoroethanol, TFE）可以轉化為豐富的α-螺旋結構。圖中顯示了pH值為2的鹽酸溶液中的Concanavalin A和50％ TFE溶液的光譜圖，分別指示了β-折疊和α-螺旋。
圖11 、Concanavalin A的CD光譜圖
核酸（Nucleic acids）
核酸，如具有雙螺旋結構的DNA和參與蛋白質合成的RNA，量測產生的CD光譜圖可反映其結構。其中一個例子是通過CD測量發現左旋Z形DNA結構。CD信號的符號是識別左旋和右旋的關鍵。對於核酸來說，最常見的CD測量類型是溫度依賴性測量。可以追蹤核酸雙鏈解開的熔化過程，並根據結構變化來分析熱穩定性。
圖12、DNA解離曲線（左）與DNA雙螺旋結構的熱穩定性（右）
微量取樣（Microsampling）
進行CD測量時，如果使用1 mm的光路長槽座，需要約400 μL的樣品體積。然而，對於非常珍貴的樣品，可以使用微型取樣盤來測量更小的量。只需將樣品滴在已組裝的盤中心的防水塗層區域即可簡單地測量CD光譜（見圖13）。可測量的體積範圍為2 μL（光路長0.2 mm）至10 μL（光路長1 mm）。圖14顯示了牛胸腺（Bovine Thymus）DNA溶液10 μL滴量和常規400 μL圓柱細胞（Cylindrical Cell）樣品的結果。可以看到，盡管樣品大小相差40倍，但CD光譜幾乎相同。
圖 13、 樣品裝載
圖14 、牛胸腺DNA的CD光譜圖
使用停流法（Stopped-flow Method）的快速動力學
使用停流法可以追蹤光學活性物質的反應過程。這種方法可用於評估反應速率、短暫中間產物以及反應的抑制劑和促進劑。特別是，它已應用於蛋白質的折疊分析中。利用這種方法在毫秒時間內跟蹤CD信號的變化，可以可視化蛋白質變性和手性分子結構變化。圖15顯示了D-葡萄糖醛酸內酯（D-glucuronolactone）在水性KOH溶液中水解過程中CD信號的變化。
圖15 、D-葡萄醣醛酸內酯水溶液的水解過程中CD信號變化圖
多樣本篩選（High-throughput CD, HTCD）
CD在監測蛋白質結構變化方面的有效性已經有所描述，近年來，除了CD外，同時測量UV吸收和螢光，以及涉及溫度和pH變化的多參數測量已變得普遍。同時，對於許多樣本進行全自動化測量的需求正在迅速增加。為了實現定制的醫療治療，如核酸藥物和抗體藥物，對所需手性分子的篩選是不可或缺的，且CD儀器必須具有高通量測量能力。
圖 17、光譜 QC 測試程式
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